产品采集与样品处理

于同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品1/4样品用于检测，1/4样品用于留样,另1/2样品(可就地封存)必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应有破裂,检验前不得启开。

在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样,准确称取10g土1g样品。剪碎后加人到200mL灭菌生理盐水中,充分混匀,得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。

如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50mL递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

细菌菌落总数与初始污染菌检测方法

本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数(以下统称为细菌菌落总数)检测。

操作步骤

待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种5个平皿,每个平皿中加入1mL样液,然后用冷却至45C左右的熔化的营养琼脂培养基15~20mL倒人每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置35C士2C培养48h后,计算平板上的菌落数。

大肠菌群检测方法

操作步骤

取样液5mL接种50mL乳糖胆盐发酵管,置35℃士2C培养24h,如不产酸也不产气,则报告为

大肠菌群阴性。如产酸产气,则划线接种伊红美蓝琼脂平板,置35C士2C培养18~24h,观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽,也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉红色,中心较深的菌落。

取疑似菌落1~2个作革兰氏染色镜检,同时接种乳糖发酵管,置35C2C培养24h,观察产气情况。

绿脓杆菌检测方法

操作步骤

取样液5mL.加人到50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置35C士2C培养18~24h。如有绿脓杆菌生长,培养液表面呈现一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板,置35C士2C培养18~24h,观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不长。

取可疑菌落涂片作革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验:

氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液,30s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性,不变色者为阴性。

绿脓菌素试验:取2~3个可疑菌落,分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面,35C士2℃培养24h加入三氯甲烷3~5mL,充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解,待三氯甲烷呈蓝色时,用吸管移到另一试管中并加人1mol/L的盐酸1mL,振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。

硝酸盐还原产气试验:挑取被检菌落纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中,置35℃士2℃培养24 h.培养基小倒管中有气者即为阳性。明胶液化试验:取可疑菌落纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置35C士2℃培养24h,取出放于4~100.如仍呈液态为阳性,凝固者为阴性。42C生长试验:取可疑培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,置42C培养24~48h,有绿脓杆菌生长为阳性。

金黄色葡萄球菌检测方法

操作步骤

取样液5mL,加入到 50 mL SCDLP 培养液中，充分混匀，置 35℃士2C培养 24 h。

自上述增菌液中取1~2接种环,划线接种在血琼脂培养基上,置35℃士2培养24~48h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。挑取典型菌落,涂片作革兰氏染色镜检,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄状,无芽胞与荚膜。镜检符合上述情况，应进行下列试验:

H露醇发酵试验:取上述菌落接种甘露醇培养液,置35C士2℃培养 24 h,发酵甘露醇产酸者为阳性。

血浆凝固解试验:玻片法:取清清干燥线玻片,一端滴加一满生理点水,另一端滴加一滴兔血浆,排取菌落分别与生理盐水和血浆混合,5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块,而盐水滴仍呈均匀混浊无疑固则为阳性，如两者均无疑固则为阴性。凡盐水酒与血浆酒均有配固现象,再进行试管额局酶试验:试出法:吸取1:4新鲜血浆0.5m放灭商小试管中,加人等量待检菌 24h 肉汤培养物 0.5 mL。混匀放35C士2C温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各 0.5 mL作为阳性与阴性对照。

溶血性链球菌检测方法

操作步骤

取样液 5mL 加人到 50 mL 葡萄糖肉汤,35C士2C培养 24 h。

将培养物划线接种血琼脂平板,35C士2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板上为灰白色,半透明或不透明,针尖状突起,表面光滑,边缘整齐,周围有无色透明溶血圈。挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检,应为革兰氏阳性,呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况,应进行下列试验:

链激酶试验:吸取草酸钾血浆0.2mL(0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀,经离心沉淀,吸取上清液),加人0.8mL灭菌生理盐水,混匀后再加人待检菌 24h肉汤培养物0.5 mL和0.25%氯化钙0.25mL.,混匀,放35℃士2℃水浴中，2min观察一次(一般10min内可疑固),待血浆凝固后继续观察并记录济化时间。如2h内不浴化，继统放营24h观察，如块全部器化为阳性,24h仍不溶化为阴性杆菌肽嫩感试验:将被检菌菌液涂于血平板上,用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上,同时以已知阳性菌株作对照,在35℃土2℃下放置18~24h,有抑菌带者为阳性。

真菌菌落总数检测方法

操作步骤

待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数。共接种5个平皿,每个平皿中加人1mL样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基 15~25mL倒人每个平川内混合均匀,琼脂凝固后翻转平肌置25C士2C培养7天,分别于35、7天观察,计算平板上的菌落数,如果发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。

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